Elle fut édifiée et sculptée entre 1491 et 1496 par des artistes flamands dans le pur goût Gothique flamboyant en tuffeau blanc à l'initiative de Charles VIII.

 La chapelle sert ensuite d'oratoire à Anne de Bretagne, avant de devenir la dernière demeure présumée du corps de Léonard de Vinci, mort à Amboise en 1519.